Studies on the Elimination Reaction of Rhodotorula gracilis D-Amino Acid Oxidase with β-Chloro-D-alanine

a c i d a H a s a p r o t o n v i a t h e s o c a l l e d " c a r b a n i o n m e c h a n i s m " . a p r o c e s s t h a t r e q u i r e s a n a c t i v e s i t e b a s e . O n t h e o t h e r h a n d , t h e w o r k o n p k D A A O r e c o n s t i t u t e d w i t h t h e a r t i f i c i a l f 1 a v i n 5 < l e a z a F A D ( 3 ) f a v o r e d a h y d r i d e m e c h a n i s m p r o c e e d i n g v i a t r a n s f e r o f t h e s u b s t r a t e a C H t o t h e f 1 a v i n N ( 5 ) . M o r e r e c e n t l y t h e t h r e e < l i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f p k D A A O ( 4 , 5 ) a n d o f t h e e n z y m e f r o m t h e y e a s t R h o d o t o r u l a g r a c i l i s ( R g D A A O ) h a s b e e n r e s o l v e d ( 6 ) . T h e h i g h r e s o l u t i o n o f t h i s l a t t e r s t r u c t u r e i n c o m p l e x w i t h v a r i o u s s u b s t r a t e s / l i g a n d s s h o w s t h a t t h e o r i e n t a t i o n o f t h e f 1 a v i n c o f a c t o r a n d o f t h e s u b s t r a t e i s i n f a v o r o f a h y d r i d e m e c h a n i s m . T h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t a l r e s u l t s a l s o s u p p o r t t h i s c o n c l u s i o n : a l i n e a r e n e r g y c o r r e l a t i o n c a r r i e d o u t w i t h T . v a r i a b i l i s D A A O a n d p a r a s u b s t i t u t e d p h e n y l g l y c i n e s s h o w t h a t l i t t l e o r n o c h a r g e d e v e l o p s i n t h e t r a n s i t i o n s t a t e a n d t h a t d e h y d r o g e n a t i o n p r o c e e d s v i a c o n c e r t e d r u p t u r e o f t h e t w o i n v o l v e d b o n d s ( 7 ) ; t h e e f f e c t s o f p H , s o l v e n t i s o t o p e e f f e c t s a n d p r i m a r y i s o t o p e r e p l a c e m e n t o n D A l a a n d D A s n d e h y d r o g e n a t i o n b y R g D A A O a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e a b s e n c e o f f u n c t i o n a l g r o u p s e s s e n t i a l t o a c i d / b a s e c a t a l y s i s a t t h e a c t i v e c e n t e r o f D A A O ( 8 ) ; a l l a c t i v e s i t e r e s i d u e s o f R g D A A O c a r r y i n g f u n c t i o n a l g r o u p s c a p a b l e o f b a s e c a t a l y s i s ( n a m e l y Y 2 2 3 , Y 2 3 8 , R 2 8 5 a n d t